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詳細解答逆轉錄操作過程中問題
點擊次數:1141 更新時間:2022-10-17

逆轉錄(reverse transcription)是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程,即 RNA 指導下的 DNA 合成。在實際的操作過程中,還會有各種問題,現做詳細解答!

1. 如何提高 RT-PCR 反應的靈敏度與特異性?

① 確定模板 RNA 完整性好,無 DNA 污染。

② RNA 模板中不應含有擴增反應抑制劑。

③ 使用適量的模板 RNA ,模板量太多會降低特異性,太少會導致擴增不出條帶或條帶太弱。

④ 若模板中有二級結構,可通過提高逆轉錄反應溫度來提高擴增效果。


2.  RNA 中含有逆轉錄抑制劑時,怎么處理?

逆轉錄抑制劑包括:SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等??蓪⒁汛_定的高質量 RNA 模板同樣品混合,同高質量 RNA 模板比較產量以檢測 RNA 抑制劑;若高質量模板 RNA 與樣品混合后產量降低,則說明樣品中存在逆轉錄抑制劑,可用70%(v/v)乙醇對 RNA 沉淀進行清洗,以除去抑制劑。


3. 逆轉錄后的 qPCR 實驗 Ct 值偏大或者普通 PCR 產量低。

① RNA 模板質量差,需要重新制備 RNA 模板,可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。

② 逆轉錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉錄試劑成分,可能會對后續(xù)的PCR 產生抑制作用,所以可以適當梯度提高 cDNA 稀釋比例(通常來說可將 cDNA 原液稀釋5-10倍,其最佳模板加入量以擴增得到的 Ct 值在20-30個循環(huán)為好)。

③ 起始的 RNA 模板量低,需要減少稀釋倍數或增加 RNA 模板量。

④ 基因本身原因(復雜和長度),可以重新設計復雜基因的引物,避免復雜結構。或者用三步法程序或延長兩步法程序的延伸時間。

⑤ 逆轉錄或者定量產品性能差,可以通過做平行不用品牌產品對比實驗,對比逆轉錄產品性能。


4. 逆轉錄酶擴增效率評估,應該關注哪些指標?

建議: qPCR-ct 值,或者 PCR 產量

如果想比較逆轉錄性能,最為直接的還是后續(xù)做 qPCR 或者 PCR 平行對比實驗,這種方法相對較為準確。

不建議:cDNA 中間產物濃度測定 or 其他方法。

逆轉錄完成后是不建議測定產物濃度的,由于逆轉錄后產生 RNA-cDNA 雜交鏈,溶液中的 RNA 和部分 DNA 會對吸光值產生影響,所以測定出來的產物濃度并不準確,即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進行對比實驗,由于不同品牌之間的逆轉錄體系具有或多或少的差異,其體系中的各種離子等都能對吸光度產生影響,所以測定的結果也沒有可比性。