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簡述白色念珠菌PCR試劑盒反應(yīng)的要素
點(diǎn)擊次數(shù):996 更新時(shí)間:2022-07-26
  白色念珠菌PCR試劑盒因其操作簡單,靈敏度高,特異性好,經(jīng)濟(jì)安全等特點(diǎn)而在臨床上廣泛應(yīng)用,但是由于其操作步驟復(fù)雜,一般包括試劑準(zhǔn)備,樣本收集,加樣,溫育,洗滌,顯色,比色,結(jié)果判定等,其中任何一項(xiàng)操作不當(dāng)都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生很大影響。
 
  今天咱們來了解下白色念珠菌PCR試劑盒反應(yīng)的要素:
 
  引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:
 
  1、引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。
 
  2、引物擴(kuò)增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
 
  3、引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC*隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
 
  4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
 
  5、引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
 
  6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
 
  7、引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
 
  8、引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
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